Ing. Josue Gálvez Suasnabar
Zootecnia – Universidad Nacional Agraria La Molina
El objetivo del estudio fue comparar el efecto de dilutores (basados en lecitina de soya y basados en liposomas) sobre las variables de calidad y funcionalidad de los espermatozoides después de la descongelación evaluados mediante análisis de esperma asistido por computadora. Se analizaron un total de 40 eyaculados de cuatro toros de la raza Brown Swiss de 3 a 6 años de edad; los tratamientos fueron: T1, eyaculados diluidos en lecitina de soya; T2, eyaculados diluidos en liposomas. El análisis de la motilidad espermática se obtuvo con ayuda de un sistema computarizado de análisis seminal (CASA); para el estudio de viabilidad espermática se empleó la tinción de fluorescencia Hoeschst 33342/PI, y la evaluación de la funcionalidad de la membrana espermática se realizó a través del test de endosmosis.
En la parte estadística, se verificó los supuestos de normalidad (Shapiro-Wilk) y la homogeneidad de varianzas (Test de Levene), posteriormente se realizó el análisis de varianzas (ANVA), y los datos se analizaron con el programa estadístico Statgraphics Centurion.
Se determinó que no hubo diferencias estadísticas significativas (P<0,05) en los parámetros de porcentaje de motilidad total (75.20 % y 75.51 %), viabilidad (60.65 % y 60.80 %) y funcionalidad de la membrana espermática (49.05% y 51.48%). Se concluye que los dilutores Andromed y Optixcell presentaron valores aceptables de la calidad seminal postdescongelación, y pueden utilizarse para la criopreservación de semen de toro.
1.- Introducción
La criopreservación de semen es una biotecnología reproductiva elemental que promueve la conservación del espermatozoide por tiempo indefinido, y la alianza con la inseminación artificial ha hecho posible la diseminación de material genético de óptima calidad.
Asimismo, la criopreservación ha generado una reducción en los costos de producción al no utilizar reproductores en monta natural, y además disminuir los contagios por enfermedades de transmisión sexual (Hammerstedt et al., 1990; Castelo et al., 2008). Sin embargo, el proceso de criopreservación genera cambios abruptos de temperatura, como el shock de frío y calor, la formación de cristales de hielo y su disolución durante los procedimientos de congelación y descongelación, afectando la integridad de las células espermáticas tanto a nivel extrínseco como intrínseco (Watson, 1999).
Con el propósito de reducir el daño de los espermatozoides producto de la criopreservación en un principio se adicionaba yema de huevo a los dilutores como crioprotector (Crespilho et al., 2012). Pero, debido a riesgos de contaminación bacteriana, la variabilidad de su composición y la dificultad cuando se utiliza técnicas de análisis asistido por computadora, ha hecho que su uso disminuya (Aires et al., 2003; Singh et al., 2012). Una alternativa para reemplazar los componentes de origen animal en los dilutores es la lecitina de soya, componente de origen vegetal que presentan una mezcla de fosfatidilcolina y una serie de ácidos grasos como el ácido esteárico, oleico y palmítico, otorgando estabilidad a la estructura, a las células (Chaudhari et al., 2015). Por otro lado, los dilutores a base de liposomas son una opción más reciente como medios de congelación. Los liposomas contienen una composición y concentración de fosfolípidos óptimas que aseguran la protección celular ante las lesiones criogénicas (Bergeron y Manjunath, 2006). Asimismo, se cree que los liposomas mediante la unión a las membranas de los espermatozoides regulan el intercambio de colesterol y fosfolípidos, protegiéndolos en el proceso de criopreservación (Ropke et al., 2011, Ansari et al., 2016).
Algunos dilutores a base de liposomas se han comparado con los dilutoresa base de lecitina de soya para la criopreservación de semen de toros encontrándose diferentes resultados de calidad seminal, superiores (Murphy, 2018), similar (Lima-Verde, 2017) y más bajo (Miguel-Jimenez, 2020). En este contexto, el objetivo de este estudio fue comparar el efecto de dos dilutores comerciales (basados en lecitina de soja y otro basado en liposomas) sobre las variables de calidad y funcionalidad de los espermatozoides después de la descongelación evaluados mediante análisis de esperma asistido por computadora.
2.- Semen bovino
El semen es la suspensión celular líquida que está compuesto por gametos masculinos (espermatozoides) y el plasma seminal. El espermatozoide es una célula haploide, cuya función es fecundar el ovocito. Este se produce en el epitelio germinal de los túbulos seminíferos de los testículos, y está conformada de una cabeza aplanada portadora del núcleo y una cola que se subdivide en los segmentos medio, principal y caudal, siendo este último el elemento esencial para la motilidad celular. El espermatozoide entero está cubierto por la membrana plasmática y el acrosoma, el cual es una estructura de doble pared situada entre la membrana plasmática y la porción anterior de la cabeza del espermatozoide. El plasma seminal representa la porción líquida del semen, y se forma durante la eyaculación. Este plasma es una mezcla de líquidos secretados por las glándulas vesiculares, conductos deferentes y próstata (Hafez, 2000).
2.1. Membrana espermática
La estructura de la membrana espermática está compuesta fundamentalmente de lípidos, proteínas y un reducido porcentaje de carbohidratos, presentando diferencias entre las especies biológicas (Ávila-Portillo et al., 2006). Presenta una estructura dinámica que actúa en la identificación y transporte de moléculas, está altamente compartimentada, y en cada compartimiento presenta una composición y organización particular, lo que origina propiedades físicas y funciones singulares (Pérez et al., 2002). Estos compartimientos son fundamentalmente: el núcleo necesario para el almacenamiento estable del ácido desoxirribonucleico (ADN), la cabeza del cual destaca la porción anterior, fundamental para la apropiada activación acrosómica y el segmento posterior indispensable para la unión espermatozoide-ovocito y finalmente la red mitocondrioflagelar que es importante en el metabolismo y motilidad del espermatozoide, asimismo, el efecto de la crioconservación es distinto en cada uno en los compartimentos (Hammerstedt et al., 1990; Tartaglione y Ritta, 2004).
2.1.1. Composición de la membrana espermática
Los componentes más abundantes de la membrana plasmática son los lípidos (fosfolípidos y colesterol). El empaquetamiento y la localización de estas moléculas determinarán la rigidez de las membranas citoplasmáticas y por consiguiente el transporte de moléculas (Mathews et al., 2003). Asimismo, el perfecto funcionamiento de la membrana espermática y del acrosoma, está relacionado con el buen estado de las estructuras de la cabeza, núcleo y el acrosoma del espermatozoide, pudiendo asegurar el éxito de la fecundación (Palacin et al., 2020).
Las moléculas lipídicas de las membranas celulares tienen la particularidad de ser anfipáticas o anfifílicas, presentando un extremo hidrofílico y el otro hidrófobo. Varias investigaciones han demostrado que existe una diferencia considerable en el perfil lipídico de la membrana plasmática de los espermatozoides, entre distintas especies de mamíferos (Tapia et al., 2012). Flesch y Gadella (2000), mencionan que un promedio estándar de la membrana plasmática contiene aproximadamente un 70 por ciento de fosfolípidos, 25 por ciento de lípidos neutros y un cinco por ciento de glicolípidos.
2.2. Criopreservación de semen bovino
La criopreservación de semen es una importante biotecnología reproductiva, que tiene como objetivo principal prolongar la viabilidad de los espermatozoides de forma ilimitada. Pero, la exposición de los espermatozoides a temperatura ambiente o de refrigeración disminuyen su viabilidad, debido principalmente al agotamiento de las reservas energéticas (Hammersted et al., 1990). Por lo tanto, con el propósito de conservar la viabilidad, es importante que los espermatozoides se encuentren a temperaturas por debajo a – 130 °C, y así detener los procesos metabolitos (Medeiros et al., 2002). Así mismo, el potencial fertilizante de los espermatozoides dependerá de un adecuado proceso de criopreservación, siendo medido a través de la integridad y funcionalidad de las distintas estructuras celulares (Hammersted et al., 1990). El protocolo de criopreservación comprenden cinco fases: dilución, refrigeración, adición del crioprotector, congelación y
descongelación (Watson, 1995). Cada fase del protocolo genera un efecto en la estructura, la función de la membrana y el metabolismo celular (Hammersted et al., 1990).
En consecuencia, el espermatozoide podría perder su integridad y funcionabilidad en algunas de estas fases (Watson, 2000; Ávila-Portilllo et al., 2006). Además, cabe mencionar que el proceso de criopreservación altera la integridad del ADN de los espermatozoides (Waterhouse et al., 2010).
2.2.1. Dilutores para la congelación
El dilutor es una solución acuosa que permite incrementar el volumen del eyaculado, conservando las características vitales de los espermatozoides y manteniendo la fertilidad (Gadea, 2003). Asimismo, debe cumplir ciertos requerimientos vinculados con su pH, capacidad buffer, osmolaridad y fuerza iónica. Además, han de proporcionar una fuente de energía para el espermatozoide, y conservar sus propiedades durante el almacenamiento previo a su uso. También, debe aportar protección a la célula espermática frente a los efectos de refrigeración, congelación y descongelación. Por último, debe inhibir el crecimiento bacteriano (Melrose,1962; Mann, 1964).
En los últimos años los dilutores no han experimentado cambios significativos en su composición. Generalmente, los dilutores utilizados para la criopreservación de semen incluyen como principales componentes: agua bidestilada (disolvente), sustancias iónicas y no iónicas (buffer), materiales orgánicos (yema de huevo o leche), agentes crioprotectores (normalmente glicerol), azúcares simples (fuente de energía y crioprotectores) y antibióticos. (Salisbury et al., 1978; Vishwanath y Shannon, 2000; Barbas y Mascarenhas, 2009).
2.2.2. Crioprotectores
Los crioprotectores tienen la función de proteger a las células espermáticas de las lesiones generadas en el proceso de criopreservación, y en las últimas décadas se han descubierto varios compuestos con propiedades crioprotectoras sobre las células. Asimismo, el grado de penetración en las membranas celulares ha determinado la clasificación de los crioprotectores en agentes penetrantes o no penetrantes (Meryman, 1971).
Algunos crioprotectores penetrantes son: glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), el metanol y algunos polialcoholes (Jones y Martín, 1965; Nagase y Tomizuka, 1968; Salamon, 1968; Wilmut y Polge, 1977). Dentro de estos crioprotectores destaca el glicerol, considerándose el crioprotector universal más utilizado en los espermatozoides de especies mamíferas (Polge et al., 1949). La eficacia de este crioprotector ha sido atribuida a su capacidad de capturar el agua y contribuye a la formación de pequeños cristales de hielo (Medeiros et al., 2002).
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