Ing. Josue Gálvez Suasnabar
Zootecnia – Universidad Nacional Agraria La Molina
2.3. Evaluación de la calidad seminal
La evaluación de la calidad seminal o espermiograma es importante en todo centro de inseminación artificial (IA), debido a que nos permiten predecir la capacidad fecundante de las células espermáticas del reproductor.
Asimismo, a lo largo de los años se han desarrollado diferentes pruebas in vitro para las muestras de semen como la evaluación de la motilidad, concentración, morfología y la funcionabilidad de la membrana espermática. Actualmente, estas pruebas se pueden realizar mediante sistemas computarizado de análisis seminal (CASA), permitiendo reducir los tiempos de análisis y obteniendo datos más objetivos sobre las características estructurales y funcionales de las células espermáticas (Muiño,2008).
2.3.1. Concentración espermática
La concentración espermática mide el número de espermatozoides por mililitro de un eyaculado, y esta concentración varía entre 800- 2000 millones de espermatozoides/ ml en los toros. Además, los eyaculados presentan diferencias de concentración espermática notorias entre reproductores (Hafez, 2000).
La concentración puede calcularse mediante distintas técnicas como: hemocitómetro (Büker, Thoma, Naubauer), espectrofotometría o citometría de flujo (Woelders, 1990; Olegario et al., 2007). Al principio se utilizaba el hemocitómetro como técnica frecuente en los centros de IA, pero la evaluación de varias muestras de semen demandaba mucho tiempo (Boixo, 1996). Por tal motivo, se utilizó la técnica de espectrofotometría, mediante el uso de un equipo de espectrofotómetro.
Esta técnica se basa en la absorción o dispersión de la luz provocada por los espermatozoides en suspensión, y de manera indirecta permite estimar la concentración espermática. En consecuencia, el uso del hemocitómetro se utiliza para evaluar un número reducido de muestras, y para determinar la curva de calibración de espectrofotómetros (Olegario et al., 2007).
Varios centros de IA aseguran que cada dosis seminal presenta como minino 10 millones de espermatozoides vivos y con motilidad progresiva, con lo cual garantizan la fertilidad. Sin embargo, en algunos reproductores extraordinarios pueden disminuirse a valores de 5 o 6 millones de espermatozoides vivos por dosis sin afectar su capacidad fecundante (Januskaukas et al., 1996).
2.3.2. Motilidad y cinética
La motilidad es un parámetro necesario para el desplazamiento de los espermatozoides a través del tracto reproductor de la hembra, y así llegar a fecundar el ovocito.
Asimismo, la motilidad presenta una correlación positiva con la viabilidad e integridad de la célula espermática. Sin embargo, este parámetro de calidad seminal por sí solo no predice la aptitud fecundante del espermatozoide (Holt y Van Look, 2004; Ormachea et al., 2019).
El análisis de la motilidad espermática se puede evaluar de manera subjetiva, y se define como la valoración visual de la motilidad espermática, siendo el análisis más simple, accesible y económico. Sin embargo, los resultados obtenidos dependen fundamentalmente de la habilidad y experiencia del observador, provocando un error humano involuntario al realizar la evaluación (Graham et al., 1980; Rodríguez-Martínez, 2000). Por otro lado, existe un método indirecto que se basa en el uso de equipos que emplean sistemas computarizados de análisis seminal denominados CASA, permitiendo obtener datos objetivos y repetibles de la motilidad, así como los parámetros cinéticos de los espermatozoides (Davis et al., 1995).
Además, permite describir a través del seguimiento del desplazamiento, características del movimiento flagelar de los espermatozoides asociándolas a su estado funcional (Kastelic y Thundathil, 2008).
Los equipos CASA presentan varias unidades interdependientes como: un microscopio de contraste de fases conectado a una cámara de video, que envía una imagen desde el microscopio a un monitor. Luego, la imagen es enviada desde el monitor a una computadora, donde un analizador digital de imagen captura varias fotografías seriadas de cada campo del microscópico, realizándose en menos de 1 segundo. El software diferencia a los espermatozoides de otras partículas que puedan aparecer
en la imagen por su tamaño, y analiza la trayectoria recorrida por cada espermatozoide individual durante esa fracción de segundo (Verstegen et al., 2002).
Amann y Katz (2004), mencionaron que el análisis del desplazamiento de la cabeza del espermatozoide a través de los sistemas CASA presentan varios parámetros generales; entre estos hallamos el porcentaje de espermatozoides inmóviles, lentos, medios, rápidos y progresivos. Asimismo, otros parámetros precisan la cinética de cada espermatozoide como la velocidad curvilínea (VCL), la velocidad media (VAP) y la
velocidad rectilínea (VSL), los índices de linealidad (LIN), rectitud (STR) y de oscilación (WOB), obtenidos de las variables anteriores.
A pesar que los principios básicos utilizados para el análisis de las imágenes digitalizadas son similares en los diferentes sistemas CASA, existen diferencias visibles en sus sistemas ópticos, técnicas de captura de imagen y reconocimiento espermático, algoritmos utilizados para la reconstrucción de trayectorias y determinación de las medidas cinéticas, y también en el manejo y análisis de los datos, y estos son expresados en los resultados finales. (Davis y Katz, 1993; Davis y Siemers,
1995; Irving, 1995; Krause, 1995; Mortimer, 2000). Por tal motivo, Verstegen et al., (2002), mencionaron que los diferentes sistemas CASA no presentan una estandarización y optimización de los equipos, y de los procedimientos empleados en los análisis, lo cual genera resultados distintos para los mismos parámetros en evaluación. Además, que existen una serie de consideraciones prácticas y biológicas que afectan a los resultados obtenidos con el CASA.
2.3.3. Viabilidad
La membrana plasmática del espermatozoide es importante para la fecundación, una membrana plasmática intacta y funcional es fundamental para que la célula espermática pueda realizar los eventos de capacitación y reacción acrosomal oportuna, y finalmente penetrar al ovocito. Estos eventos desarrollados simultáneamente determinan la capacidad fecundante de un espermatozoide (Jeyendran et al., 1984; Burks y Saling, 1992).
La evaluación de la viabilidad espermática se puede realizar con el uso de tinciones supra vitales y mediante microscopía óptica convencional. Sin embrago, su uso se encuentra restringido a la evaluación del semen fresco, debido a que el glicerol y otros aditivos utilizados en el proceso de congelación del semen interfieren con la coloración.
Los colorantes más usados en la evaluación seminal convencional son el Azul tripan y la Eosina-Nigrosina, permitiendo observar la cabeza del espermatozoide muerto de color azul en el caso del Azul tripan o color rosado en el caso de la Eosina- Nigrosina. El espermatozoide viable con la membrana plasmática íntegra, rechaza el colorante y no presenta coloración (Swanson y Bearden, 1951).
En la actualidad se usan técnicas específicas para valorar la viabilidad espermática que aplican un marcaje fluorescente del ADN, mediante el uso de dos fluorocromos combinados: uno de ellos sólo es capaz de atravesar las membranas plasmáticas dañadas o degeneradas, y por tanto permite identificar a las células muertas o en proceso de degeneración, mientras que el otro es capaz de atravesar membranas celulares intactas, permitiendo identificar la población de células viables (Garner, 1997).
Las tinciones más comunes son el SYBR-14 y el ioduro de propidio (PI), rodamina 123, naranja de acridina y Hoescht 33342 (Gillan et al., 2005). El SYBR-14 suele utilizarse en combinación con PI y de esta forma se pueden distinguir dos poblaciones espermáticas, una de ellas constituída por células muertas o en estado de degeneración, cuyas membranas plasmáticas son permeables al PI, y por tanto emiten fluorescencia roja; y la otra constituída por espermatozoides viables, cuyas membranas intactas son impermeables al PI, pero dejan entrar el SYBR-14, y por tanto emiten fluorescencia verde. Un fluorocromo con un mecanismo similar al del SYBR-14, capaz de identificar espermatozoides vivos, es el Hoechst.
- Este compuesto también entra en células vivas y se une al ADN espermático, sin embargo, su uso está limitado por la longitud de onda de su espectro de excitación, que está en el rango ultravioleta (Muiño, 2008). En relación a la valoración de la viabilidad espermática, este ha sido uno de los parámetros seminales más estudiados debido a que juega una función decisiva en la fecundación (Cabrera y Pantoja, 2012), y solo los espermatozoides que son viables podrán realizar la reacción acrosomal de manera sincronizada con la fase de penetración del ovocito y, como efecto, fusionarse con éste para producir un embrión (Januskauskas et al., 2001).
2.3.4. Test de endosmosis
El test de endosmosis o HOS tiene como objetivo evaluar si una membrana está intacta y es bioquímicamente activa, considerando que el espermatozoide sea móvil y que sea capaz de realizar la fecundación, no así ocurre con el espermatozoide que se encuentra en malas condiciones y que no será capaz de fecundar (Zavos, 1990).
La prueba HOS, fue diseñada para evaluar la función de la membrana del esperma (Jeyendran et al, 1984). Su principio se basa en la observación de las alteraciones morfológicas (aumento de tamaño) en los espermatozoides expuestos a condiciones hipoosmóticas (Correa y Zavos, 1994). La prueba hipoosmótica tiene como principio colocar una muestra de espermatozoides en un medio hipoosmótico produciendo un desequilibrio osmótico entre el medio extracelular e intracelular, generando que la célula compense fisiológicamente circulando agua al medio intracelular y, como consecuencia aumenta su volumen y se observan cambios morfológicos en los flagelos o colas como enrollamiento de los mismos, con la cual se comprueba que la membrana plasmática tiene un actividad funcional normal (Sánchez y Garrido, 2013). En toros, como en otras especies, se han señalado correlaciones altas y positivas entre el HOS y el porcentaje de espermatozoides vivos, la motilidad espermática, el porcentaje de espermatozoides normales y la fertilidad in vivo e in vitro, tanto del semen fresco como para el semen descongelado (Aisen et al., 2002).
El ensayo HOS también puede resultar útil para evaluar el daño de la membrana inducido mediante procedimientos de criopreservación (Zavos, 1990). Así mismo, para realizar la prueba de HOS en bovinos, se ha sugerido el uso de fructosa y citrato de sodio diluido en agua destilada a 100 mOsm/l (Jeyendran et al., 1984; Correa y Zavos, 1994).
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