Autores: Ing. Zoot. Erika Maribel 1 Vilcatoma Suaznabar, Ing. Saúl Espinoza Molina2
1, 2 Facultad de Zootecnia, Universidad Nacional del Centro del Perú
Colección de embriones
En la actualidad, la técnica más usada para la recolección de embriones bovinos es la colección no quirúrgica (transcervical). Consiste en lavar varias veces el cuerno uterino con el medio de colección. Esto se consigue introduciendo el catéter de Foley a través del cérvix hasta la curvatura mayor del cuerno, lugar donde se fija y se infla el globo del catéter, el cual se une a la manguera. Por una parte, de la bifurcación entra el medio al útero, cada vez que se llena este se le da un masaje, posteriormente se extrae el medio el cual sale hacia el filtro colector de embriones. Una vez lavado un cuerno, se saca el catéter y se repite la operación en el cuerno opuesto. El momento indicado para realizar la colección es entre el día 6.5 a 7 de iniciado el estro, debido a los tipos de estructuras que se encuentran en estos días considerando que los embriones pasan del oviducto al cuerno uterino en el cuarto o quinto día. Después de la colección embrionaria las donadoras reciben una inyección de PGF2α con el objeto de inducir la regresión de los CL, evitar una posible gestación, incluso múltiple y acortar el periodo entre colecciones.
Método de colección no quirúrgica Al encontrar la posibilidad de colocar una sonda a través del cérvix en la especie bovina, logró nuevas posibilidades para la recolección de embriones, de este modo simplificó el procedimiento y a su vez disminuyó el trauma uterino. Para fines comerciales, se colectaron los embriones entre los días 6-8 después del estro e inseminación artificial. Antes de este tiempo, muchos embriones se encontraban en el oviducto, razón por la cual no podrían ser recolectados por medio no quirúrgicos. Las hembras donantes deben ser manejadas de manera adecuada, con el objetivo de evitar cualquier factor de estrés.
Búsqueda de embriones
El medio de lavado recolectado debe ser vertido en una placa para facilitar la búsqueda de embriones. La búsqueda se realiza bajo lupa con platina térmica a 38 ºC. Se recomienda efectuar siempre una segunda lectura de la placa. A medida que se identifican los embriones, los mismos son aspirados mediante micropipeta y colocados en una caja de Petri con un medio de conservación enriquecido con suero al 20%, resguardo de la luz y a temperatura de laboratorio. Una vez finalizada la búsqueda, se procede a la clasificación de los embriones. De ser posible es importante utilizar una campana y aire filtrado. Cabe recordar que se debe trabajar en condiciones estrictas de esterilidad.
Según Reyes (2010), lo primero que se tiene que hacer antes de aislar los embriones es lavar el filtro con el medio para poder obtener embriones que se pudieran haber quedado adheridos en la pared de este o en la periferia del recipiente recolector. Para localizar, identificar, aislar, manipular y clasificar embriones y óvulos sin fertilizar se requiere de considerable experiencia. Sin embargo; desde el momento en que los embriones son colectados deben ser manipulados con técnicas estériles y tan pronto como sea posible se beben colocar en el microscopio y lavar 3 veces en el mismo estéril, para posteriormente, ser evaluados, almacenados, congelados o transferidos. Los embriones deben ser aspirados con una pipeta con un pequeño volumen de medio (menos de 2ml), para evitar la contaminación del medio fresco. Los embriones deben ser manejados con mucho cuidado para evitar causarles el
mínimo daño.
Identificación de embriones
Para localizar, identificar, aislar, manipular y clasificar ovocitos infértiles y embriones (según Bó, et. al., 2010), se requiere considerable experiencia. Los embriones fácilmente pueden pasar desapercibidos así que cada caja Petri debe ser examinada por una misma persona dos veces y chequeada por otro técnico para rectificar o ratificar el número de embriones encontrados. Las donantes que son sometidas a un programa de superovulación, no ovulan al mismo tiempo sino en cascada, los embriones colectados mediante el lavado uterino en los días 7 – 8 después de la primera inseminación artificial, presentan diferentes estados de desarrollo.
Por lo cual, al ser colectados en dichos días, las estructuras que se deben encontrar serán Blastocistos y Blastocistos expandidos. Es importante recordar que en el día 9 el embrión rompe la zona pelúcida (eclosiona), o sea queda desprotegido sobre todo de virus y bacterias (la legislación de la Asociación de Trasplante de Embriones ‘IETS’, no permite congelarlos). (Palma., 2008). Podemos encontrar también blastocistos jóvenes y mórulas compactas. Si los embriones son de buena calidad en esos estadios se pueden transferir o congelar, embriones de calidad regular es conveniente implantarlos, aunque el porcentaje de gestación va a ser menor (Palma., 2008). Sánchez y Gonzales. (2019), manifiestan que el embrión de bovino tiene un diámetro de aproximadamente 160 μm (0.16mm) hasta el día 8 de desarrollo.
Por lo tanto, se requiere de un microscopio estereoscópico (aumento de 10 a 40 X) para identificar los embriones. La morfología de los embriones de bovino es similar después de la fertilización hasta el día 9 de desarrollo. La zona pelúcida se pierde del blastocisto entre el día 8 y 10. En este periodo existe un gran riego de dañarlo por el manejo, además de que son muy adhesivos y se pegan fácilmente a los tubos y a la cristalería. La identificación de los embriones se basa en varias características morfológicas: o La zona pelúcida es una estructura translucida presente en todos los embriones hasta el día 9, se distingue fácilmente de otros desechos celulares y es utilizada como referencia.
• El color del embrión (ámbar oscuro) facilita la identificación por que usualmente es más obscuro que otros desechos celulares.
• El embrión es esférico y tiende a moverse en el fondo de la superficie del plato.
• El conocimiento del estadio del embrión facilita su identificación. (Palma 2008).
Desarrollo embrionario
Tomando como referencia el desarrollo embrionario señalado por Palma (2010), quien indica que la edad del embrión es establecida a partir del día del estro (día 0). Al día 1 le corresponde la ovulación. De esta forma entre 24 y 36 horas después de la fertilización el cigoto de una célula se divide en 2 células ovales (día 2); 24 horas más tarde (día 3) el embrión cuenta ya con 4 células. La división de los blastómeros puede cumplirse en forma asincrónica, razón por la cual es posible observar en estadios tempranos un número impar de células. Hasta el estadío de 8 células (día 4) el cigoto es transportado a través del oviducto. El día 5 (aproximadamente) se produce el ingreso al cuerno uterino en estadío a la clasificación de los embriones.
De ser posible es importante utilizar una campana y aire filtrado. Cabe recordar que se debe trabajar en condiciones estrictas de esterilidad. Según Reyes (2010), lo primero que se tiene que hacer antes de aislar los embriones es lavar el filtro con el medio para poder obtener embriones que se pudieran haber quedado adheridos en la pared de este o en la periferia del recipiente recolector de 16 células, momento a partir del cual es posible obtener el embrión en forma no quirúrgica y evaluarlo de acuerdo a su estadio y calidad.
En este sentido, Orellana y Peralta (2007), manifiestan que el efecto que puede llegar a tener el estadio de desarrollo embrionario sobre los porcentajes de preñez es un factor que ha sido estudiado por diversos autores con resultados dispares. En algunos casos, blastocistos tempranos y blastocistos resultaron en mayores porcentajes de preñez que mórulas, blastocistos expandidos y blastocistos protruidos. Otros autores, obtuvieron mejores resultados con blastocistos que con mórulas. Contrariamente, otros autores no han hallado efecto del estadio de desarrollo.
Un embrión es una célula de 150- 190 μm de diámetro, incluyendo a la zona pelúcida y una capa acelular formado por glicoproteínas. Horas después de la fusión gemética se produce una célula llamada cigoto, que aproximadamente al día dos post fecundación comienza a dividirse. La división es mitótica y dichas células que se forman son llamadas blastómeros. El desarrollo del embrión hasta los 8 días ocurre dentro de la zona pelúcida.
Lugar, materiales y métodos de la investigación
Se trabajó con los registros de colección de embriones obtenidos a partir del Proyecto “Mejoramiento Genético del Ganado Vacuno mediante la Transferencia de Embriones en la Región Junín”, desarrollado en la Estación Experimental del Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA).
• Departamento: Junín
• Provincia: Huancayo
• Distrito: El Tambo
• Sede Física: Hualahoyo – Saños Grande
• Latitud Sur: 12°00’50»
• Longitud Oeste: 75° 13’11»
• Altitud: 3,260 msnm.
• Temperatura: 6 – 18 °C
• Zona de Vida: bs – MBS (bosque seco – Montano Bajo Sub Tropical)
• Cuenca Hidrográfica: Mantaro
Metodología
1) Población y muestra
La población estuvo constituida por registros de colección de embriones de vacas de la raza Brown Swiss del establo del Instituto Nacional de Innovación Agraria INIA de la unidad experimental Santa Ana Hualahoyo, Huancayo Junín. El hato de ganado bovino de la Estación Experimental Agraria Santa Ana del Instituto de Innovación Agraria, Hualahoyo, cuenta con una población de 56 vacas de la raza Brown Swiss que se consideraron
como candidatas a vacas donantes de ovocitos/embriones, que cumplan los requisitos productivos (genético) y reproductivos (anatómicos,
fisiológicos y hormonales).
Del total de vacas en producción las vacas, fueron sometidas a una respuesta del diagnóstico de estado clínico reproductivo: condición principal vacías, sin antecedentes de partos distócico, ciclando; tamaño y actividad ovárica funcional, cuernos uterinos con total involución y sin alteraciones patológicas post parto; vacas que al menos hayan tenido un parto a tres como requisitos para ser consideras como vacas donadoras de embriones, totalizando 87 vaca en los 5 años., al no contar con la población suficiente para realizar un método de muestreo se utilizó la Muestra por conveniencia.
2) Criterio de muestreo
El muestro no cabalístico, son los procedimientos que no utilizan la ley del azar, ni el cálculo de probabilidades; asume varias formas: el muestreo por juicio o a criterio del investigador, el muestreo por cuota y muestreo accidental. El muestreo por cuota: consiste en formar grupos, estratos, clases de individuos por alguna característica en común como: sexo, edad, grupos ocupacionales o nivel de instrucción, etc, pero, no aleatoriamente sino a criterio del investigador. Lo cual coincide con las vacas donadoras y sus requisitos para ser consideradas como tal.
3) Criterio de inclusión para vacas donadoras de embriones
El hato de ganado bovino de la Estación Experimental Agraria Santa Ana del Instituto de Innovación Agraria, Hualahoyo para el desarrollo
de la colección de embriones, el criterio de inclusión fue: de acuerdo a lo establecido por De Luca (2016), indica que, para obtener mejores resultados dentro de un programa de Transferencia de Embriones, las vacas donadoras deben desarrollarse en un medio óptimo para una fertilización normal y desarrollo embrionario.
* Las vacas donadoras deben ser de alto valor genético.
* Edad: tener de 3 a 10 años de edad.
* Condición corporal en la escala de 1 a 5: 2.5 a 3.0
* No presentar defectos de conformación.
* No deben existir alteraciones en su aparato reproductor (quistes, infecciones).
* Vacas libres de parásitos externos e internos.
4. Técnica e instrumentos de recolección de datos:
* Fichas de observación de las características productivas, reproductivas y examen ginecológico de las vacas donadoras de oocitos / embriones.
* Registros individuales de producción de embriones.
* Registros del establo (peso, alimentación, Nº partos).
* Protocolo de sincronización de estro y ovulación.
Número de vacas donadoras de embriones
Se eligieron 37 en el primer grupo y 21 vacas en el segundo grupo, consideradas como donadoras de embriones, dichos animales reunían condiciones genéticas y fisiológicas reproductivas mínimas para ser consideradas como tal; sin embargo no todas respondieron exitosamente al tratamiento hormonal de superovulación, por lo que se fueron reduciendo el número de vacas donantes, que mejor respuesta tuvieron a la recolección de embriones viables en cantidad y calidad; como señala (De Luca, 2018), hace mención que en los programas de transferencia de embriones a pesar de los avances logrados para el desarrollo de producción de embriones, la principal desventaja sigue siendo la imposibilidad de asegurar que una vaca sea considerada como donante potencial ya que se desconoce la respuesta que pueda tener, y por lo tanto no se puede anticipar la producción de un apropiado númerode embriones de calidad en un tiempo dado, otro de los factores es que dicha variabilidad de la respuesta de las vacas, está ligada a la respuesta superovulatoria de los tratamientos hormonales.
Entre las variaciones individuales pueden deberse también a la elección de los tratamientos superovulatorios utilizados. Del mismo modo, (Córdova, 2011), señala que la elección de una donante para la transferencia de embriones se determina por su valor genético y su capacidad para lograr un alto nivel
satisfactorio como: Presentar ciclos estruales regulares desde temprana edad, no más de dos servicios por preñez, no presentar defectos genéticos, con edad de 3- 10 años, con ciclos estruales en promedio de 17 y 24 días, sin alteraciones en su aparato reproductor. (Quistes, adherencias, infecciones, etc.), obviamente las vacas deben ser de alto valor genético, libres de endo y ectoparásitos, con una condición corporal de 3 – 3,5 en escala del 1 al 5.
Inicialmente, hemos trabajado con un alto número de vacas que reunían condiciones anatomofisiológicas reproductivas para ser consideras como vacas donadoras en total 37 y 21 vacas, que representan el 42.53 % y 24,14% del total de vacas consideradas donadoras, sin embargo, no todas respondieron positivamente al protocolo de multiovulación por diversos motivos, principalmente respuestas fisiológicas reproductivas, lo que en los años subsiguientes se ha disminuido el número de donadoras quedándonos con un número reducido de vacas que si respondían positivamente al tratamiento de multiovulación para la producción de embriones por su mejor eficiencia reproductiva.
Deja un comentario