1,2Dr. MCs Leonardo José De Luca, 3Dr. MV. Nicolás Caggiano, 2Marta Castrillon Caggiano
1Director Científico Laboratorio Burnet
2Cátedra Producción de Leche Facultad Ciencias Agrarias UNLZ
3Cátedra Fisiología FCV UBA
Se ha avanzado mucho en la comprensión del papel de la apoptosis y necrosis en respuesta a la infección bacteriana
Escherichia coli produce una serie de proteasas, incluyendo las enzimas colagenolíticas, que contribuyen a la degradación de los componentes de la membrana extracelular (ECM). No hay duda de que estas actividades proteolíticas pueden contribuir a la apoptosis y la necrosis de las células epiteliales mamarias.
Sin embargo, el grado en que contribuyen aún se desconoce. Los Lipopolisacáridos también denominados endotoxina son complejos con restos de ácidos grasos como parte lipofílica y cadenas características de oligosacáridos y polisacáridos que forman parte mayoritaria de la capa externa de la membrana de bacterias Gram-negativas. En su conjunto, forman una capa protectora hidrófila en torno a la célula bacteriana que no puede ser atravesada por moléculas lipófilas. Se considera un factor clave para la patogenicidad de esta clase bacteriana. En consecuencia, la infusión intramamaria de LPS de E. coli se utiliza a menudo para estudiar los eventos que ocurren durante la mastitis a E. coli porque imita los síntomas de mastitis de origen natural sin invasión de microorganismos y la producción de toxina, lo que podría causar directamente efectos dañinos en las células epiteliales mamarias.
Cuando los LPS se utilizaron para inducir una respuesta inflamatoria en la glándula mamaria, no se observaron lesiones en las glándulas mamarias. Del mismo modo, losLPS no causa daño en el tejido in vitro en los explantes de tejido bovino mamario lactante o células epiteliales mamarias.
Sin embargo, la posibilidad que la implicación de los LPS en la mastitis inducida por E. coli sobre el daño celular no puede ser totalmente descartado, porque los LPS estimulan la expresión de IL-1 por las células T-MAC, una línea de células epiteliales mamarias bovina.
Además, se evidenció que los LPS producen un aumento de la expresión del Activador del plasminógeno Tipo Uroquinasa (UPA) Por lo tanto es posible que el LPS induce la apoptosis o necrosis en células epiteliales mamarias indirectamente a través de la inducción de proteasas o citoquinas proinflamatorias. En este momento, sin embargo, no hay ninguna evidencia experimental que apoye esta idea, presumiblemente debido a la falta previa de métodos analíticos sensibles.
Las mastitis causadas por bacterias Gram- Negativas, tal como E. Coli, Klebsiella spp, y Enterobacter spp, pueden causar una variedad de síntoma de la enfermedad variando desde una simple inflamación local, a severos signos de enfermedad y muerte.
Los signos más severos de la enfermedad ocurren predominantemente en el período postparto inmediato, especialmente en vacas con bajos recuentos de células somáticas.
Una vez que las bacterias pasan el conducto del pezón, durante la lactación, los mecanismos de defensa celular y humoral determinan la supervivencia de la bacteria y la duración y severidad de la infección. La variación en la susceptibilidad en las vacas postparto temprano se explica por diferencias en el RECUENTO DE CÉLULAS SOMÁTICAS (CCS) en la leche, el número y función de los neutrófilos circulantes y la velocidad y magnitud de su capacidad para llegar dentro de la glándula mamaria. Este fenómeno es crítico para matar rápidamente al E. Coli y detoxificar las endotoxinas.
Los signos locales durante la mastitis Coliformes son lineales y están relacionados al número de bacteria presentes en la leche durante el primer día después de la infección. Estos signos están atribuidos a la acción de los Lipopolisacáridos (LPS, endotoxinas), mediados a través de las Citoquinas, tales como las Interleuquinas y el Factor Necrosante de Tumores, los cuales son producidos por las células del sistema inmune de la ubre en respuesta a las endotoxinas.
Los Lipopolisacáridos se unen a las proteínas de unión, formando un complejo. Este se une a las moléculas CD14 ubicadas sobre los macrófagos y neutrófilos, produciéndose de esta manera la síntesis y liberación del Factor Necrosante de Tumores. La respuesta a esta liberación varía extensamente entre vacas, y la severidad de la inflamación depende de la concentración de esta citoquina.
Muchas infecciones por E. Coli causan casos clínicos agudos, los cuales a veces son autolimitantes y se eliminan espontáneamente entre los 5 a 7 días después de la infección; sin embargo también se han descrito infecciones después de 70 a 90 días del contagio.
Aproximadamente 10 a 15% de las infecciones resultan hiperagudas que frecuentemente se convierten en mastitis crónica, con reagudizaciones frecuentes. Las infecciones han sido descriptas frecuentemente como persistentes en el período seco.
En un estudio reciente hemos podido comprobar que sobre 200 vacas analizadas, el 45% de los casos de coliformes diagnosticados durante los primeros 90 días de lactancia, surgió en los cuartos que estaban infectados con el mismo patógeno durante el período seco. De Luca et al., 2010 comenta que la Staphylococcus aureus produce toxinas que destruyen las membranas celulares, directamente dañan los tejidos y provocan necrosis en las glándulas mamarias bovinas. Inicialmente, las bacterias dañan los tejidos que recubren el pezón y cisternas glandulares en el cuarto.
Si no se controla, invaden el sistema de conductos y establecen puntos profundos de la infección en las células secretoras de leche (es decir, los alvéolos). Esto es seguido por el encapsulado de las bacterias por tejido de cicatrización y la formación de abscesos. Se proporcionaron evidencias de que el Staphylococcus aureus indujo apoptosis en las células epiteliales mamarias de la glándula de la especie bovina.
Se demostró que 2 horas después de la internalización de un Staphylococcus aureus se aíslan células MAC-T que exhiben desprendimiento de la matriz, membrana celular moteadas, y vacuolización del citoplasma, todos los cuales son indicativos de células sometidas a la apoptosis. Por 18 horas, la mayoría de la población de células MAC-T mostró una morfología apoptótica. Otra evidencia de apoptosis fue la existencia de un patrón de ADN característico positiva con TÚNEL positivo etiquetado típico de las células apoptóticas.
Estos resultados demuestran claramente que después de la internalización, del Staphylococcus aureus escapa del endosoma e induce la apoptosis en células epiteliales mamarias. La apoptosis depende de factores de virulencia global tales como Agr Sar así como por las Caspasas 8 y 3.
El Agr (gen accesorio regulador) o sistema QS (acrónimo en inglés Quorum sensing o percepción de Quorum) tiene un enorme impacto en el éxito del patógeno en la infección controlando la fisiología y los factores de virulencia. Este sistema Agr regula la expresión de toxinas y la degradación de exoenzimas como las proteasas. Tiene una baja regulación de varias proteínas de adhesión durante la fase estacionaria de crecimiento de la bacteria. Aunque todavía no hay evidencia directa que demuestra que Staphylococcus aureus induce la apoptosis de las células epiteliales mamarias bovinas in vivo, esto parece probable.
El Staphylococcus aureus produce una amplia variedad de exoproteínas que contribuyen a su capacidad para colonizar y causar enfermedad en huéspedes mamíferos. Casi todas las cepas secretan un grupo de enzimas y citotoxinas, que incluye 4 hemolisinas (α, β, λ, y δ), nucleasas, proteasas, lipasas, hialuronidasa y colagenasa. La función principal de estas proteínas puede ser para convertir los tejidos locales huéspedes en los nutrientes requeridos para el crecimiento bacteriano. Algunas cepas producen una o más exoproteínas adicionales, que incluyen síndrome de choque tóxico toxina-1, enterotoxinas estafilocócicas, toxinas exfoliativa y leucocidina.
Las cepas aisladas de casos de mastitis bovina expresaron toxinas α, β, λ y δ, leucocidina, enterotoxinas y coagulasa.
Entre todas las citotoxinas del Staphylococcus aureus, la α-Hemolisina ha sido la más examinada. La misma puede inducir la apoptosis y/o necrosis en células eucarióticas, dependiendo de la dosis dada. En dosis bajas, la toxina se une areceptores de superficie celular específicos aún no identificados y produce pequeños poros que facilitan la liberación selectiva de iones monovalentes, lo que resulta en la fragmentación del ADN y la muerte celular característica.
A dosis altas, la α-hemolisina inespecíficamente absorbe a la bicapa lipídica y forma poros más grandes en la membrana que son Ca++permisiva, lo que resulta en una necrosis masiva sin fragmentación del ADN.
Otras toxinas bacterianas también podrían tener efectos dañinos en los tejidos mamarios de la especie bovina, pero no se han estudiado intensamente. Glándulas mamarias inoculadas con enterotoxina estafilocócica C sufren degeneración celular epitelial, incluyendo invaginación y vacuolización citoplásmica de las células epiteliales. No está claro si este efecto es debido al aumento de la producción de superóxido por PMN migrado o si se trata de un efecto directo de la enterotoxina en las células epiteliales mamarias.
Definitivamente, el Staphylococcus aureus continúa siendo el mayor problema para la industria lechera debido a la naturaleza del contagio y a la refractoriedad a los tratamientos habituales. El mismo tiene varios mecanismos de virulencia que le permiten la adhesión, colonización, multiplicación y difusión aún en presencia de componentes celulares y humorales del sistema inmune.
La adhesión hacia la superficie de las células epiteliales mamarias o hacia el tejido subepitelial está facilitada en este caso por una proteína de unión, la fibronectina, por los polisacáridos capsulares y por la secreción viscosa que se encuentra sobre la superficie de ciertas cepas.
Los Staphylococcus aureus que desarrollan en la leche, producen polisacáridos capsulares que interfieren con la unión o el reconocimiento de anticuerpos y complemento hacia la superficie celular, por lo que los receptores C3b y Fc. Sobre los neutrófilos no pueden adjuntarse a las bacterias. Este es un principio similar al ejercido por la proteína A, la cual se une a la IgG en su fracción Fc. Previniendo tanto la opsonización como la fagocitosis.
La resistencia contra los mecanismos de defensa inmunológicos está causada en parte por la habilidad del Staphylococcus de multiplicarse en las células del epitelio mamario e incluso en los fagocitos. Una vez que la adhesión y la colonización está establecida, la infección es diseminada y mantenida.
El daño celular directo se inicia con la acción de diversas toxinas, especialmente α y β toxinas, cuya acción se amplifica por el resultado de la respuesta inflamatoria. De esta forma, los pequeños conductos intra-alveolares pueden ser bloqueados, conduciendo a la formación de micro abscesos y pérdida del tejido funcional de la ubre.
El cuadro clínico de la mastitis a Staphylococcus aureus es muy diverso y obviamente depende de las propiedades de la virulencia de las cepas infectantes y del funcionamiento del mecanismo de defensa de la vaca.
Luego de la infección, el cuadro clínico puede ser descripto como mastitis clínica, con leche anormal y ubres edematizadas y frecuentemente signos sistémicos de enfermedad (fiebre, depresión, baja producción láctea). Gradualmente, después de varios días, los signos sistémicos desaparecen y la infección se torna crónica
o subclínica.
La curación espontánea depende de varios factores, pero en las vacas en plena lactancia (primeros tres meses), la autocura usualmente es menor al 10-20%.
En las infecciones crónicas o subclinicas, el derramamiento del Staphylococcus. aureus en la leche puede ser continuo, aunque un patrón cíclico de difusión contribuye al aumento del recuento de células somáticas. Cada vez que disminuye el recuento de células somáticas recrudece el derramamiento y difusión de la bacteria, reagudizando y agravando la infección.
La epidemiología de la infección intramamaria a Staphylococcus aureus, como de otras bacterias, depende tanto de las características del germen como de la susceptibilidad del huésped. Dentro de las características de este agente patógeno, una muy importante es su patrón invasivo irregular, lo cual complica el diagnóstico. Este patrón irregular no es un rasgo común a todas las cepas de Staphylococcus aureus y muy probablemente, juega un importante rol en la difusión de cepas dentro del rodeo lechero.
Las cepas del Staphylococcus aureus pueden ser caracterizadas por su habilidad a resistir a la fagocitosis. Específicamente se ha demostrado que las cepas más comunes son también las más eficientes para evadir las defensas inmunes. Esta última observación es el vínculo entre la característica de la bacteria con la susceptibilidad de la vaca, sugiriendo que el sistema inmune en la ubre juega un rol importante en la epidemiología de esta infección mamaria.
Efectivamente, el Staphylococcus aureu tiene una extensa interacción con el sistema inmune no solo durante las fases de invasión y colonización sino también durante la curación ya que su porcentaje depende de la actividad de las células inmunes. Por ejemplo la actividad fagocítica puede estar elevada, como dijimos, por la presencia de anticuerpos opsonizantes, con la presencia de cápsulas o pseudocápsulas, estos anticuerpos deben estar sobre las estructuras capsulares y su producción depende de la actividad de los Linfocitos T; sin embargo estas células se encuentran hipo reactivas cuando los cuartos están infectados con Staphylococcus aureus. Esta condición se debe a la producción de superantígenos (endotoxinas) producidas por las cepas más patógenas de Staphylococcus aureus.
La infección intramamaria definitivamente se encuentra asociada con diferentes respuestas de los sistemas o factores inmunes de la leche. La proporción de PMN (Polimorfos nucleares), su viabilidad y la actividad NAGase* (N-acetil-β Dglucosaminidasa*) se encuentran elevadas, mientras que la lisozima y la explosión respiratoria de los PMN se encuentra baja en la leche de los cuartos afectados comparados con los sanos.
La reducción de la actividad de la lisozima es el resultado de un agotamiento precoz de los PMN, mientras que la deficiencia en la explosión respiratoria se debe a una actividad deficiente de los neutrófilos. Definitivamente durante las fases tempranas de la infección se eleva el recuento de neutrófilos en la leche de los cuartos enfermos. Si la infección perdura los PMN se agotan precozmente y los que llegan al lugar presentan una deficiente actividad fagocítica. Si a esta condición relacionada al tipo de bacteria actuante se le agrega un desbalance o deficiente ingesta de minerales/vitaminas antioxidantes el desencadenamiento de la infección intramamaria se agrava a veces hasta la pérdida total del cuarto afectado.
NAGase* “es una enzima responsable de la degradación de los mucopolisacáridos y glucoproteínas de las células. Esta enzima se encuentra en los lisosomas de todas las células del organismo en bajas concentraciones. Su elevación refleja inflamaciones agudas cuando se detecta la presencia de altos recuentos en leche de leucocitos polimorfos nucleares, participación de proteínas plasmáticas y citoquinas en el daño tisular.
En el inicio de la mastitis, el aumento de la permeabilidad de la barrera sangre-leche epitelial mamaria conduce primero a una afluencia de los componentes de suero, tales como plasminógeno y numerosas otras enzimas, y segundo a un reclutamiento masivo de células somáticas, en particular, La leche contiene 2 sistemas de proteinasas derivados de la sangre, uno de los cuales está involucrada en la disolución de coágulos de sangre (es decir, la plasmina) y el otro en la defensa contra los microorganismos invasores (es decir, proteinasas lisosómicas de las células somáticas).
Considerando que la plasmina es la proteinasa principal en la buena calidad de la leche, otras proteinasas, incluyendo catepsina y elastasa, son probablemente también activas, en particular cuando el recuento de células somáticas de la leche aumenta. Esto es sustentado por la observación de que las actividades de la proteasa de plasmina y leche con mastitis difieren. Además, las células epiteliales mamarias también expresan metaloproteinasas (MMP) y serina proteasas, que están implicados en la activación de plasminógeno a plasmina.
El sistema activador de plasminógeno a plasmina en la leche bovina se correlaciona estrechamente con la involución gradual La plasmina degrada directamente las proteínas de la matriz tales como la fibrina, y laminina y también activa precursores de MMP, tales como pro-MMP-3, MMP-9 y MMP-13.
El aumento de la actividad de la plasmina durante la mastitis está relacionada con la permeabilidad de la barrera epitelial durante la inflamación. Además, numerosos activadores de la plasmina y su pro enzima o zimógeno provienen de la circulación sanguínea, de los PMN, y de las bacterias. Durante la mastitis, la concentración del activador proteasa de serina, incluyendo aquellos para la plasmina y el plasminógeno en la sangre y también en la leche, aumenta bruscamente.
Los neutrófilos polimorfo nucleares tienen un pool de activadores de plasminógeno, tal como uPA (Activador de Plasminógeno tipo Uroquinasa) y en menor medida activadores del plasminógeno tisular tPA. Algunas bacterias, como Staphylococcus aureus, E. coli y Salmonella typhimurium, expresan un receptor de plasminógeno en sus superficies que lo activa y expresa en plasmina luego de su inmovilización.
Cuánta plasmina contribuye al daño tisular durante la mastitis es discutible. La viabilidad de las células epiteliales mamarias depende de su unión a la Matriz Extracelular (ECM), así es que es razonable postular que la degradación de ECM está implicada en el daño tisular y la muerte celular durante la mastitis. La expresión de MMP-9, ARNm para estromelisina-1 y uPA también se incrementan en asociación con la apoptosis durante la mastitis a E. Coli.
La MMP-9 es producida por PMN bovino y por células T MAC. La Estromelisina-1 contribuye a la ruptura de la mayoría de los componentes de ECM, incluyendo laminina y colágeno tipo IV. Otras proteasas que se han reportado elevadas en la leche de vacas con mastitis incluyen MMP-2 y una Gelatinasa de 120 kDa.
También se evaluó la actividad proteolítica sobre el tejido normal mamario de vacas con mastitis. Encontraron que el lacto suero proveniente de vacas con mastitis era más proteolítica que el lacto suero de leche de vacas normales.
El Lacto suero de vacas con mastitis exfolia las células y proteínas que las rodean, dejando una red desnuda de colágeno denso. Estas diferencias resultaron de contenidos y actividades de proteasa, que eran significativamente más altos en leche con mastitis.
Se llega a la conclusión que el daño con proteólisis tisular observada eran en gran parte debido a MMP. Sin embargo, la posible contribución de otras proteasas no debe ser ignorada.
Las citoquinas son mediadores centrales de los eventos inflamatorios durante la infección intramamaria (IMI). Las bacterias liberan toxinas potentes que activan las células blancas de la sangre y las células epiteliales de la glándula mamaria para secretar citoquinas.
El desafío intramamario con E. coli o Staphylococcus aureus ha provocado respuestas inmunes innatas diferenciales en términos de síntomas clínicos y de perfiles de la leche de citoquinas a nivel de proteínas. La diferencia en los perfiles de citoquinas puede ser la base de las diferencias en el seguimiento de los síntomas de estos 2 tipos de mastitis.
Muy pocos trabajos se han llevado a cabo para determinar el papel de las citocinas en la regulación del daño tisular durante la mastitis. Las citoquinas reclutan PMN que funcionan como fagocitos en el sitio de la infección. Durante un estudio sobre la utilización de IL-8 recombinante bovino (rb) como un potencial agente terapéutico para la mastitis subclínica de vacas lecheras se observó un aumento significativo en el recuento de células somáticas de leche y en la actividad de quimioluminiscencia después de la inyección intramamaria de rbIL-8.
Aunque no estudiaron el daño a los tejidos, los niveles altos de los recuentos de células somáticas de leche y la producción de radicales libres, sin duda han dado lugar a daño tisular. Previamente se ha informado de que rbIL-8 puede inducir la migración de PMN a través de un modelo in vitro.
Otras citoquinas, tales como factor de necrosis tumoral-α e IL 1-, inducen la apoptosis en una variedad de tipos de células, incluyendo células endoteliales bovinas y células epiteliales mamarias humanas.
Los niveles de estas citoquinas aumentan durante la mastitis a E. coli y es tentador suponer que también inducen apoptosis en células epiteliales mamarias bovinas.
Una gama de citoquinas también se conocen para promover una amplia variedad de funciones de los PMN, incluyendo la adhesión, la expresión del receptor de superficie, producción de radicales libres, y la liberación de los constituyentes lisosomales Por lo tanto, los efectos de las citoquinas en el daño tisular son más propensos a ser mediada a través del reclutamiento y activación de PMN.
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